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2 de agosto de 2021

ELISA: Conheça as suas principais características

O nome ELISA vem de um acrônimo  do inglês “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”, uma técnica baseada em reações do tipo antígeno anticorpo, que são detectáveis com reações enzimáticas.

ELISA

A Técnica ELISA é muito utilizada em escala mundial, devido a sua praticidade de uso para várias amostras e sua habilidade de amplificação robusta do sinal com alta sensibilidade e especificidade para a quantificação de anticorpos e antígenos em fluidos biológicos de natureza complexa (BORGES, DEMARGOS & HATANAKA, 2021).

Esta técnica foi descrita pela primeira vez por Yalow e Berson (1959). Foi relatado pelos autores uma técnica que utilizava a detecção de anticorpos com a ligação de um sinal radioativo, e devido aos riscos relativos à radioatividade, o método foi modificado (TIGHE et al., 2015). 

Foi então que ensaios laboratoriais demonstraram que algumas combinações de enzima-substrato eram capazes de alterar a coloração do meio, e que essa alteração era quantificável, e por este motivo, iniciou-se a busca por combinações de enzima-substrato que associadas a anticorpos poderiam ser detectadas.

Em 1971 dois grupos de pesquisa na Europa publicaram o processo do Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) (Engvall e Perlmann, 1971; Van Weemen e Schuurs, 1971).

Os cientistas Engvall e Perlmann foram os grandes responsáveis pela modificação do método e o estabelecimento da técnica ELISA que conhecemos hoje, utilizando enzimas para marcar o antígeno, ao invés do método com iodo radioativo. No ensaio, foi realizado o experimento para observar os níveis de IgG em soro de coelho.

Utilização

Essa técnica é utilizada para  detecção e diagnóstico de  diferentes doenças infecciosas,doenças autoimunes, alergias, infecções fúngicas, bacterianas, parasitárias e virais.

Assim, é possível observar se em algum momento aquele organismo entrou em contato com estes agentes.

Por isso, a ELISA é amplamente utilizada em laboratórios de biotecnologia, farmacêutica e clínica no geral.

Apesar do avanço da biotecnologia e o avanço e criação de técnicas de detecção, o papel dessa técnica na biologia molecular permanece significativo, ainda sendo um dos mais sensíveis dos imunoensaios, oferecendo alto rendimento, combinado com acessibilidade e facilidade de uso.

Nos últimos 20 anos, houve um refinamento de tecnologias de alto rendimento para todas as áreas denominadas como Ômicas (genômica, proteômica, transcriptômica e lipidômica, metabolômica, entre outras). 

Com isso, os laboratórios de Biologia Molecular possuem atualmente a possibilidade de desenvolver (ou até mesmo comprar) biomarcadores, que no caso do ELISA, são utilizados para diagnosticar patologias ou até mesmo estudar organismos com muito mais precisão.

Tipos de Testes ELISA

Os testes do tipo ELISA são normalmente padronizados em laboratórios de referência para a detecção de anticorpos com sensibilidade e especificidade para os anticorpo.

Esse método versátil é capaz de forma quantitativa e qualitativa especificar uma substância, que normalmente é um antígeno, que é imobilizado quimicamente em uma microplaca ou diretamente, por um anticorpo de captura.

Existem 4 tipos principais: ELISA direta, ELISA indireta, ELISA sanduíche e ELISA de bloqueio.

A ELISA direta é realizada utilizando um anticorpo de detecção primária, formando assim um complexo antígeno-anticorpo. Então, o anticorpo de detecção primária é marcado diretamente com a enzima. 

A  ELISA indireta é semelhante a ELISA direta, mas se utiliza um anticorpo secundário marcado,apresentando maior especificidade na detecção.

A Elisa sanduíche é realizada utilizando um antígeno aderido a um suporte sólido, como a placa de ELISA  (geralmente deixado para se ligar à placa previamente, o que comumente chamamos de sensibilizar a placa) e a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno.

Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos.

Outro método é a ELISA de bloqueio ou competição, em que a presença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno. Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.

Esse método é menos utilizado, porém menos importante, pois é o método ideal  quando o alvo possui poucos epítopos de ligação ou é muito pequeno.

Após a adição de enzimas que alteram a coloração do meio, é realizado o ensaio de medição da densidade óptica para análise.

Como manter a qualidade?

É importante salientar que a solução tampão deve se manter em um pH estável conforme as instruções do fabricante, pois assim os antígenos irão permanecer solúveis e o seu resultado será confiável.

Além disso, a integridade da amostra também é um fator muito importante. Apesar da técnica Elisa ser capaz de detectar em fluidos complexos (sangue, sobrenadante, urina e etc.), existem diversos estudos demonstrando que amostra deve ser bem conservada ou não será possível detectar nada (BORGES, DEMARGOS & HATANAKA, 2021).

Outro fator importante nesse experimento é a utilização dos controles e padrões de amostra de forma correta. Normalmente os kits de ELISA já fornecem padrões que possuem as concentrações conhecidas do analito.

É preciso a partir disso realizar uma curva padrão, que é a pipetagem de diluições em séries de uma concentração conhecida, para ser possível avaliar o resultado. Além disso, recomenda-se a curva de controle positivo, de controle negativo e de um branco.

Como técnica de ELISA é uma técnica  sempre empregada em detecção e diagnóstico, existem sempre melhoramentos e variações no tipo e aplicabilidade, como por exemplo o PCR-ELISA.

A associação do PCR ao ELISA, torna possível realizar a detecção de proteínas, ou seja, é realizado um ensaio imunológico para quantificar o produto de PCR biotinilado. Em uma microplaca são realizadas as etapas de amplificação, imobilização e detecção da proteína-alvo.

Outro uso que foi recentemente criado foi uma ELISA modificada para a detecção de Covid-19 por grupos brasileiros, que modificaram a técnica para uma detecção facilitada, mais rápida, segura e barata.

A Biolinker oferece vários produtos para a técnica de ELISA e detecção de Covid-19. Acesse nosso site e confira!

Referências

AYDIN, S. A Short History, Principles, and Types of ELISA, and Our Laboratory Experience with  Peptide/Protein Analyses Using ELISA. Peptides, v. 72, p. 4–15, out. 2015.

BORGES,L.; DEMARGOS,A.; HATANAKA,E., Technical bioanalytical considerations for detection and quantification of cytokines in ELISA assays Cytokines, , v89, jun 2021

SHAH, K.; MAGHSOUDLOU, P. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): The Basics. British journal of hospital medicine (London, England : 2005), v. 77, n. 7, p. C98-101, jul. 2016.

SUE, M. J. et al. Application of PCR-ELISA in Molecular Diagnosis. BioMed research international, v. 2014, p. 653014, 2014.

TANNER, J. M. et al. Evaluation of Factors Associated with Positive IgM Capture ELISA Results in Equids with Clinical Signs Compatible with West Nile Virus Infection: 1,017 Cases (2003). Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 228, n. 3, p. 414–421, fev. 2006.

TIGHE, P. J. et al. ELISA in the Multiplex Era: Potentials and Pitfalls. Proteomics. Clinical applications, v. 9, n. 3–4, p. 406–422, abr. 2015.

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