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31 de maio de 2021

Phage Display: como utilizar para obter seu peptídeo-alvo

O Phage Display é uma técnica que precisa de um especialista como nós auxiliar você a realizar a síntese de peptídeos-alvo!

O que é o Phage Display?

Uma das técnicas de Biologia Molecular mais exploradas nesse momento é o Phage Display, em que são selecionados ligantes peptídicos a partir de bibliotecas genômicas.

O Phage Display é utilizado por nós cientistas para realizar a seleção de peptídeos in vitro, sendo assim, é necessário que você ligue as suas moléculas de interesse aos peptídeos de superfície de um bacteriófago filamentoso.

Como é utilizado?

Atualmente em laboratórios de Biologia Molecular, os projetos estão cada vez mais robustos e com isso há o aumento na demanda para pesquisa e desenvolvimento.

Mesmo com o avanço da Biologia Molecular ao longo dos anos, sabemos que essa técnica não é simples.

Então é preciso que você conheça um profissional qualificado para identificar falsos positivos/negativos, assim como utilizar os controles corretos para obter os resultados desejados.

Normalmente, a biblioteca de bacteriófagos obtida com esse processo é utilizada para seleção por afinidade ao alvo (em geral outra proteína) em ciclos positivos de afinidade.

Como Funciona

O “Phage” e o “Display”

Primeiro você precisa dos bacteriófagos, os fagos (“phages”), para apresentá-los (“display”) para um “alvo” (que podem ser proteínas, pequenas moléculas, células etc) que você quer que esses fagos se liguem.

Essa é a parte mais importante do Phage Display, e também é onde fica seu segredo: esses fagos não são todos iguais.


Na solução de fagos que é misturada com o alvo, existe uma quantidade enorme de fagos ligeiramente diferentes um do outro, em torno da mesma quantidade de pessoas na terra: bilhões!

A principal diferença entre eles são pequenos peptídeos de, por exemplo, cerca de 12 aminoácidos Essa cadeia peptídica foi projetada por cientistas para ficarem expostos para fora da cápsula do bacteriófago, podendo assim entrar em contato com o “mundo” ao seu redor.

Imagem dos fagos com os peptídeos no capsídeo

Como objetivo do Phage Display é encontrar um peptídeo que se ligue com grande afinidade ao alvo, pode ter certeza que dentre as bilhões de possibilidades de peptídeos, haverá pelo menos uma possibilidade que terá uma combinação de aminoácidos com o formato e carga elétrica corretos para se ligar perfeitamente ao alvo.

Resumindo: se você não tem a chave certa para a fechadura que você quer, basta ir tentando bilhões de chaves até encontrar a que você precisa.

O Vírus Bacteriófago Guarda a Informação

Mas como isolar e saber qual é o peptídeo certo que estará junto com as outras bilhões de possibilidades? É por isso que ao invés de só misturar bilhões de peptídeos com o alvo, são misturados os fagos que possuem esses peptídeos.

Porque os fagos, além de terem os peptídeos, guardam a sequência genética que gerou aqueles peptídeos, o DNA.

Então ao invés de fazer análises muito caras e complicadas usando a quantidade ínfima daquele peptídeo ideal que se ligou ao alvo, basta aproveitar o fato de que o bacteriófago é “especialista” em se multiplicar.

Aí basta cultivá-lo, extrair então uma quantidade o suficiente de DNA viral e sequenciá-lo – técnica que hoje em dia é muito acessível e barata.

Força Bruta na Fechadura

O sucesso desse método acontece por “força bruta”. Não há uma análise racional de qual poderia ser o melhor peptídeo que se ligaria ao alvo, mas sim uma quantidade enorme de tentativa-e-erro.

Por isso, dentre as bilhões de possibilidades, não será ligado ao alvo apenas aquele peptídeo de alta afinidade. Também vão se ligar milhares de fagos com peptídeos que se ligam “mais ou menos” bem, junto com o peptídeo que se está tentando filtrar do resto – lembrando aqui que, em solução, não se tem apenas uma unidade do “alvo”, mas também bilhões de alvos iguais uns aos outros, entrando em contato com as diferentes possibilidades de peptídeos presas aos fagos!

Para se livrar desses peptídeos indesejados, o alvo precisa ser lavado.

Então, ao contrário dos fagos indesejados, o alvo precisa estar em alguma coisa que o segure no recipiente da solução.

Uma maneira simples de se fazer isso é usar um recipiente plástico muito limpo e adsorver o alvo à ele – o que é, em si, uma tecnologia à parte.

Imagem demonstrando o antes e depois da lavagem

Depois de lavado, os fagos que ainda permanecem ligados ao alvo são soltos.

Isso é feito ou pela alteração da carga elétrica geral da solução (a “força iônica” – mudando o pH, e/ou adicionando íons, como sal) ou adicionando-se mais alvos em solução, fazendo-os “competir” pela ligação dos fagos “presos” aos alvos adsorvidos e assim os libertando para a solução.

Seleção Artificial dos Mais Aptos (a se ligar no alvo)

Mas depois disso ainda se terá em solução milhares de peptídeos de baixa afinidade de ligação pelo alvo – que pelo menos foram capazes de não irem para o descarte depois da lavagem.

É por isso que o Phage Display necessita de ciclos sequenciais de exposição dos fagos ao alvo: todos esses bacteriófagos recuperados são multiplicados juntos em uma cultura de bactérias, e depois extraídos e expostos novamente ao alvo, repetindo tudo de novo, num novo ciclo.

Quando isso acontece, no momento da exposição dos fagos ao alvo, não se terá mais bilhões de fagos diferentes entre si, mas milhares ou centenas de fagos diferentes entre si, porém aos milhões!

É esse passo em que ocorre a competição das possibilidades de peptídeos: existe nos alvos (lembre-se: há um alvo, mas com milhões de cópias dele em solução) apenas um lugar para se ligar, então a possibilidade de peptídeo que se ligar com mais afinidade vai ganhar a disputa com outras possibilidades de menor afinidade, deixando-a de fora para ir embora com a lavagem!

Ao final de 3 ciclos, a seleção está completa. Partindo de bilhões de possibilidades, praticamente apenas um tipo de fago restará: aquele com a sequência peptídica de alta afinidade pela proteína.

Chegando a um Consenso

É bem frequente que ao final você acabe com mais de um tipo fago que se ligou com alta afinidade, mas analisando a sequência dos peptídeos deles, em geral, há um consenso.

Ou seja: apesar de variações pontuais de aminoácidos aqui e ali na cadeia peptídica, há uma grande similaridade geral das possibilidades.

Um teste biofísico estimando o grau de afinidade de ligação entre o alvo e cada possibilidade de peptídeo selecionada (por, por exemplo, calorimetria titulação isotérmica, “ITC”) sempre revela que todas as possibilidades têm alta afinidade, com pequena variação entre elas.

Em alguns casos, há também a possibilidade de haver mais de um grupo de sequências-consenso dos peptídeos, o que pode indicar um local (sítio) de ligação independente no alvo – que pode interagir ou não com a dinâmica de ligação da outra sequência-consenso de peptídeo com o outro sítio de ligação.

Não sei realizar o ensaio, o que posso fazer?

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